Perfil ampliado de Remdesivir como un amplio

Jul 12, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3131 (2023) Citar este artículo

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Remdesivir (GS-5734; VEKLURY) es un profármaco monofosforamidato de diastereómero único de un análogo de adenosina (GS-441524). Remdesivir es absorbido por las células diana y metabolizado en múltiples pasos para formar el nucleósido trifosfato activo (GS-443902), que actúa como un potente inhibidor de las ARN polimerasas virales dependientes de ARN. Remdesivir y GS-441524 tienen actividad antiviral contra múltiples virus de ARN. Aquí, ampliamos la evaluación de la actividad antiviral de remdesivir a miembros de las familias Flaviviridae, Picornaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae y Hepadnaviridae. Utilizando ensayos celulares, demostramos que remdesivir puede inhibir la infección de flavivirus (como el dengue 1-4, el Nilo Occidental, la fiebre amarilla, el virus del Zika), picornavirus (como enterovirus y rinovirus) y filovirus (como varios virus del Ébola, aislados de los virus de Marburgo y Sudán, incluidos nuevos aislados geográficos), pero es ineficaz o significativamente menos eficaz contra los ortomixovirus (virus de la gripe A y B) o los hepadnavirus B, D y E. Además, remdesivir no muestra ningún efecto antagonista cuando se combina con favipiravir, otro análogo de nucleósido antiviral de acción amplia, y tiene una interacción mínima con un panel de medicamentos concomitantes. Nuestros datos respaldan aún más el remdesivir como un agente antiviral de amplio espectro que tiene el potencial de abordar múltiples necesidades médicas no satisfechas, incluidas las relacionadas con la preparación antiviral para una pandemia.

Remdesivir (RDV; GS-5734; VEKLURY), el primer antiviral aprobado por la FDA para tratar la COVID-19, es un profármaco monofosforamidato de diastereómero único de un análogo de adenosina (GS-441524). Una vez absorbido por las células, el RDV se metaboliza en múltiples pasos para formar el nucleósido activo 5′-trifosfato (TP), un potente inhibidor de múltiples ARN polimerasas virales dependientes de ARN. RDV tiene actividad de amplio espectro contra muchos virus de ARN en cultivos celulares, incluidos los coronavirus (SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV)1,2,3,4,5,6,7, picornavirus (enterovirus 71 [EV71] y coxsackievirus B3)8, filovirus (virus Ébola [EBOV], virus Sudán [SUDV], virus Bundibugyo, virus Marburg [MARV])9,10,11, neumovirus (virus respiratorio sincitial [RSV])10,11 ,12 y paramixovirus (virus Nipah [NiV], virus del sarampión y virus Hendra)13,14. RDV tiene actividad moderada contra el virus Lassa y el virus Junin en la familia Arenaviridae, y contra el virus de la fiebre hemorrágica Alkhurma transmitido por garrapatas, el virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur, el virus de la fiebre hemorrágica de Omsk y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas en la familia Flaviviridae10,13. El RDV tiene una actividad antiviral mínima contra el virus chikungunya y el virus de la encefalitis equina venezolana de la familia Togaviridae, el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) de la familia Retroviridae, el virus de la fiebre del Valle del Rift de la familia Phenuiviridae, el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo de la familia Togaviridae. familia Nairoviridae y virus de la estomatitis vesicular de la familia Rhabdoviridae10,13. Se desconocen los motivos de las variaciones en el perfil de actividad, pero probablemente reflejan diferencias sutiles en el sitio activo de las ARN polimerasas virales dependientes de ARN15.

En este estudio, ampliamos la evaluación de la actividad antiviral del RDV a otros miembros de las familias Flaviviridae, Picornaviridae, Filoviridae (con nuevas cepas), Orthomyxoviridae y Hepadnaviridae. Para la preparación para una pandemia, en el caso de que sea necesario combinar varios medicamentos para mejorar la actividad antiviral y, en consecuencia, la eficacia, también mostramos una falta de antagonismo entre RDV y favipiravir, otro análogo de nucleósido antiviral amplio aprobado, en ensayos antivirales contra dos filovirus representativos. Además, demostramos que no existe antagonismo entre RDV y un panel de medicamentos concomitantes comúnmente utilizados en regiones endémicas de SUDV y MARV.

La potencia del RDV contra el VRS y varios coronavirus in vitro se ha perfilado ampliamente1,3,4,5,6,7,12. Confirmamos que RDV es potente contra los coronavirus endémicos OC43 y 229 E, con un valor de EC50 de 0,067 µM en células Huh7 y 0,093 µM en células H1 HeLa respectivamente (Tabla 1). En ensayos de infección celular, RDV inhibió los enterovirus 68D y 71 con valores de CE50 de 0,050 y 0,140 μM, respectivamente. La potencia de RDV contra rinovirus de serotipos A y B osciló entre valores de CE50 de 0,385 a 0,750 μM en células H1 HeLa. Por el contrario, RDV fue inactivo contra la influenza A y B (EC50 > 50 μM; Tabla 1).

Se ha informado que las actividades de GS-441524 contra el virus del dengue-2 (DENV-2), el virus de la fiebre amarilla (YFV) y el virus del Niles Occidental (WNV) son EC50 de 9,46, 11 y > 30 µM, respectivamente19. En este estudio, se evaluó la actividad del RDV contra flavivirus en ensayos infecciosos basados ​​en células. Las células Huh-7 se trataron con concentraciones crecientes del compuesto y posteriormente se expusieron a DENV 1–4, virus zika (ZIKV), YFV o virus de la encefalitis japonesa (JEV) que expresan una proteína informadora nanoluciferasa. La actividad luciferasa se midió en el punto final del ensayo como resultado de la infección viral. La viabilidad celular se probó en el mismo tipo de célula utilizando un ensayo luminiscente basado en ATP para medir la citotoxicidad. RDV redujo la infección por todos estos flavivirus, con la potencia más alta contra DENV (rango de CE50 = 0,12–0,23 μM; Tabla 1) y la potencia más baja contra YFV (EC50 = 1,06 μM; Tabla 1). La actividad antiviral del RDV contra el WNV se evaluó de manera similar con la excepción de que las tasas de infección viral se midieron mediante ensayos de placas de medios de cultivo en el punto final del ensayo. RDV fue un potente inhibidor de la infección por VNO (CE50 = 0,05 μM; Tabla 1).

La actividad antiviral del RDV contra filovirus se ha informado previamente en modelos de infección tanto in vitro como in vivo9,10,11,13,20. Sin embargo, estos estudios se centraron en filovirus como las variantes de EBOV Kikwit, Makona y Yambuku (aislado Mayinga), la variante SUDV Gulu y las variantes MARV Angola y Hesse (aislado Cieplik también conocido como “Ci67”) (resumidas en la Tabla 1). Para examinar la actividad antiviral del RDV contra aislados de filovirus geográfica y temporalmente distintos, se realizaron estudios de dosis-respuesta en células HeLa humanas y las tasas de infección viral se determinaron basándose en la tinción del antígeno viral en el punto final del ensayo10,21,22. La viabilidad celular se evaluó simultáneamente mediante tinción de núcleos y citoplasma de los pocillos de ensayo. Como se resume en la Tabla 1, RDV fue un potente inhibidor de todos los aislados de virus MARV y Ravn (RAVV) analizados con valores de CE50 de 0,024 a 0,068 μM. También se observó una actividad fuerte, aunque menos potente, contra todos los aislados de SUDV analizados (valores de CE50 de 0,12 a 0,24 μM).

Los primeros estudios mostraron que GS-441524 y RDV son activos contra el replicón 1b del VHC con una CE50 de 3,1 µM y 0,057 µM, respectivamente11,19. En este estudio, evaluamos la actividad del RDV contra los genotipos 1b y 2a del VHC utilizando un sistema de replicón subgenómico en el que los niveles del indicador de luciferasa de Renilla sirven como medida de la replicación del virus. RDV inhibió la actividad del replicón de ambos genotipos del VHC con eficacia similar (CE50 = 0,072–0,089 μM; Tabla 1).

Se analizó la actividad antiviral del RDV contra el virus de la hepatitis B (VHB; cepa AD38) en células HepG2 o PHH. La potencia observada de RDV fue similar a la CC50 del compuesto en estas células. Por lo tanto, el índice de selectividad del RDV frente al VHB es cercano a 1, lo que sugiere que la citotoxicidad del RDV es la causa probable del efecto antiviral medido en nuestros ensayos. RDV es inactivo contra HDV en células Huh-7 con una EC50 > 5 µM. Además, RDV fue inactivo contra el virus de la hepatitis E (replicón GT3-Kernow C1 p6/luciferasa) en concentraciones de hasta 1 µM. No se intentaron concentraciones más altas ya que se observó citotoxicidad en concentraciones de aproximadamente 4 µM.

Favipiravir (Avigan, T-705) es un análogo de nucleósido con actividad de amplio espectro contra virus de ARN como arena-, bunya-, nairo-, flavi- y filovirus23,24. Fue aprobado en Japón en 2014, pero estaba restringido para tratar infecciones por virus de la influenza nuevas o reemergentes (no la influenza estacional) contra las cuales otros medicamentos antivirales contra la influenza son ineficaces25,26.

Con su dosis aprobada (1600 mg dos veces al día el día 1; 600 mg dos veces al día los días 2 a 5), ​​favipiravir mostró una disminución dependiente del tiempo en la exposición después del uso continuo tanto en voluntarios sanos27,28 como en pacientes con enfermedad por el virus del Ébola29. En el ensayo JIKI de 2014-2015 (un tratamiento experimental con favipiravir para la enfermedad por el virus del Ébola), una dosis más alta (2400 mg + 2400 mg + 1200 mg el día 0; 1200 mg dos veces al día los días 1-9) produjo una concentración plasmática media de 46,1 μg/mL (~ 310 μM) el día 2, con una disminución de ~ 50% el día 4 (25,9 ug/mL, ~ 170 μM)29. En nuestro ensayo de infección celular, favipiravir mostró una baja actividad antiviral contra SUDV y MARV, con valores de EC50 de 507 ± 79,9 y 113 ± 9,8 µM, respectivamente (Tabla S1 y S2). También evaluamos las actividades de RDV en combinación con concentraciones de favipiravir clínicamente relevantes (23–750 μM) contra la infección por SUDV (Tabla S1) y MARV (Tabla S2). La CE50 de RDV se redujo de manera dependiente de la dosis en presencia de favipiravir (Tabla S1 y S2; reducción máxima de ≥ 5, 2 o ≥ diez veces para SUDV y MARV, respectivamente). El efecto de la combinación de compuestos sobre la CE50 de favipiravir fue similar (Tabla S1 y S2; reducción máxima de ≥ 21 o ≥ 4,8 veces para SUDV y MARV, respectivamente). La mediana del IC para la combinación RDV y favipiravir fue de 1,12 para SUDV y 1,02 para MARV (Tabla 2). Por lo tanto, en general, la combinación de estos dos compuestos parece tener un efecto antiviral aditivo simple, y no antagonista, contra SUDV y MARV. Para minimizar el sesgo del software, también utilizamos SynergyFinder (versión 3) para analizar la combinación de RDV + favipiravir por su actividad anti-MARV30 (https://synergyfinder.fimm.fi). El software produjo una puntuación de sinergia de 1,965, lo que sugiere que la combinación es aditiva según el límite convencional de puntuaciones de sinergia: > 10 indica sinergia, − 10 a + 10 indica aditividad y > 10 indica antagonismo (Fig. S1). La combinación de los compuestos no mostró evidencia de citotoxicidad, incluso en las concentraciones más altas de ambos compuestos.

Se evaluaron dieciocho agentes terapéuticos comúnmente utilizados en regiones endémicas de SUDV y MARV, incluidas terapias antivirales contra el VIH, medicamentos antipalúdicos y medicamentos utilizados para mejorar los síntomas de las fiebres hemorrágicas virales (Tabla S3, OMS 2010, 2016) para detectar posibles interacciones con RDV. Todos los medicamentos se probaron en su correspondiente concentración máxima en plasma humano (Cmax), a menos que se observara una toxicidad sustancial, lo que luego llevó a pruebas con una concentración más baja. Como se resume en la Tabla 3, los medicamentos se dividen en dos categorías: (1) aquellos que no tienen actividad antiviral contra SUDV y MARV cuando se prueban solos. La mayoría de estos fármacos mostraron un efecto mínimo sobre la potencia del RDV en estudios combinados, incluidos paracetamol, arteméter, atovacuona, diazepam, metronidazol, omeprazol, ondansetrón, proguanil, lamivudina, ritonavir y fumarato de tenofovir disoproxilo (TDF); mientras que la amodiaquina y la ciprofloxacina mejoraron la actividad del RDV contra el SUDV al reducir la CE50 > 5 veces; (2) medicamentos que mostraron actividad antiviral contra SUDV (efavirenz, lopinavir, lumefantrina y ceftriaxona se probaron solos o en combinación con RDV (Tabla 3). Ninguno de estos medicamentos mostró efecto antagonista cuando se probaron contra SARS-CoV-2 en combinación con RDV. Se observó una citotoxicidad mejorada para combinaciones de RDV con efavirenz y atovacuona a 41 y 22,6 µM, respectivamente. Estos compuestos tuvieron una citotoxicidad similar cuando se probaron solos (CC50 ≈ 14–28 µM para efavirenz y CC50 ≈ 8–17 µM para atovacuona). .

En 1998, Barrett y su colega antropólogo de la Universidad Emory publicaron su teoría sobre el aumento de enfermedades infecciosas emergentes desde finales de los años 1970, incluida la epidemia de VIH SIDA31. Propusieron tres transiciones epidemiológicas en la historia humana definidas por un patrón único de enfermedades relacionadas con la subsistencia y la estructura social en ese momento, cada una asociada con un aumento o cambio importante en el impacto de las enfermedades infecciosas: (1) la primera transición coincidió con el Neolítico Revolución, donde muchas de las infecciones humanas contemporáneas se remontan a zoonosis de animales domesticados; (2) la segunda transición ocurrió durante la Revolución Industrial a mediados del siglo XIX en Europa y América del Norte, donde los países desarrollados experimentaron una marcada disminución en la mortalidad por enfermedades infecciosas y un aumento concomitante de enfermedades no transmisibles como las degenerativas, metabólicas y de envejecimiento. enfermedades relacionadas; (3) la tercera transición se observó en la década de 1970 para los patógenos emergentes rastreados por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)32, incluidos los virus emergentes, reemergentes y resistentes a los medicamentos. Los factores que contribuyen a la aparición de nuevos virus o a la reaparición de virus incluyen el cambio climático, la alteración ecológica, la industria alimentaria animal, la globalización y las fallas del sistema de salud pública31,33. La pandemia de COVID-19 refuerza el concepto de que futuras infecciones virales pueden tener un impacto global en un corto período de tiempo, por lo que es fundamental contar con antivirales con actividad de amplio espectro34. Los últimos dos años también han puesto de relieve los desafíos que supone el cribado de bibliotecas de compuestos para identificar medicamentos existentes para una nueva indicación “reutilizada” en medio de una pandemia, al tiempo que se intenta acortar o eludir el proceso de identificación de clientes potenciales de calidad y la optimización total de los antivirales de molécula pequeña. candidatos35.

En este estudio, confirmamos la actividad antiviral de amplio espectro de RDV contra virus de ARN patógenos humanos y demostramos que RDV también es un potente inhibidor de picornavirus, flavivirus patógenos y coronavirus endémicos. La potencia antiviral observada del RDV contra flavivirus y filovirus adicionales está de acuerdo con estudios previos con miembros de esas familias virales10,13. Se ha observado actividad antiviral en múltiples tipos de células con diferentes resultados de criterios de valoración: expresión de antígeno viral, replicación viral, número de copias del genoma viral, efecto citopático y expresión de gen informador. Los miembros de familias virales con poca o ninguna sensibilidad al RDV incluyen los ortomixovirus (influenza A y B), nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica del Congo de Crimea), fenuvirus (virus de la fiebre del Valle del Rift), togavirus (virus chikungunya y alfavirus) y rabdovirus ( virus de la estomatitis vesicular). En comparación con su nucleósido original GS-441524, RDV mostró una actividad antiviral más potente contra VHC, DENV-2, YFV y WNV en ensayos celulares19, probablemente relacionado con el mayor nivel del metabolito activo 5'-trifosfato formado en las células3.

Además del tratamiento de las infecciones virales naturales, existe la necesidad de desarrollar contramedidas antivirales de amplio espectro para virus que podrían usarse indebidamente como agentes de guerra o bioterrorismo36. Una combinación de dos o más antivirales de amplio espectro es ventajosa para proteger contra patógenos desconocidos. En este estudio, demostramos que cuando RDV se combina con el antiviral de amplio espectro favipiravir, tienen un efecto aditivo, lo que hace que la combinación RDV + favipiravir sea una opción potencial en escenarios de biodefensa.

Según ensayos celulares, RDV tiene un bajo potencial de antagonismo con otros medicamentos concomitantes; sin embargo, nuestros resultados se limitan al entorno in vitro. Cualquier posible interacción farmacológica in vivo debe evaluarse por separado, ya que la farmacocinética de cada fármaco y su metabolito podría verse afectada por muchos factores del huésped más allá del alcance de este estudio. A partir de abril de 2022, la FDA aprobó el RDV para el tratamiento del SARS-CoV-2 en adultos y niños de 28 días de edad o más y que pesen ≥ 3 kg37,38. La potencia antiviral establecida, la seguridad clínica y el régimen de dosis correspondiente como tratamiento aprobado para COVID-19 deberían facilitar más pruebas clínicas e in vivo de RDV contra un espectro más amplio de virus de ARN indicados en este informe. Las evaluaciones in vivo en curso de RDV contra virus emergentes9,14 y la eficacia del profármaco disponible por vía oral del nucleósido parental de RDV pueden respaldar la ampliación de las opciones de tratamiento para infecciones virales desatendidas y emergentes, y podrían ayudar potencialmente a abordar múltiples necesidades médicas no cubiertas en enfermedades infecciosas, incluidos futuros antivirales. preparación para una pandemia39,40.

Remdesivir fue sintetizado por Gilead Sciences, Inc. Favipiravir (6-fluoro-3-oxo-3,4-dihidropirazina-2-carboxamida; T-705) se obtuvo de Fujifilm Toymana Chemical (Tokio, Japón). E864-0360 se adquirió en ChemDiv (San Diego, CA).

Se cultivaron células de carcinoma cervical humano (HeLa) (ATCC, Manassas, VA, Cat#CCL-2) durante 3 días en matraces de cultivo de tejidos T715 o T225 en medio esencial mínimo (MEM) (Corning, Corning, NY, Cat#10- 009) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (Hyclone Laboritories/GE Health Care Life Sciences, Boston, MA), L-glutamina al 10 % (Hyclone Laboritories), HEPES 10 mM (pH 7,0–7,6) (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO), 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA) (Sigma-Aldrich), 1 % de penicilina/estreptomicina (Sigma-Aldrich). Para generar placas de ensayo, se sembraron células HeLa a razón de 2000 células por pocillo (en total 40 µl por pocillo) en placas de ensayo de 384 pocillos (Aurora Biotechnologies, Carlsbad, CA, Aurora 384, IQ-EB, 384 IQ-EB/ NB, 200 mclear, Cat#1052-11130) y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos durante aproximadamente 20 h antes del tratamiento con el compuesto.

Las células de rabdomiosarcoma (RD; CCL-136), H1 HeLa (CRL-1958) y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK; CCL-34) se obtuvieron de ATCC. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (Gibco/Thermo Fisher Scientific) o en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco/Thermo Fisher Scientific) suplementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2,0 mM, 100 unidades. /ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se subcultivaron dos veces por semana en una proporción de división de 1:5 a 1:10 utilizando técnicas de cultivo celular estándar. Las determinaciones del número total de células y el porcentaje de viabilidad se realizaron utilizando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripán. La viabilidad celular fue superior al 95 % para las células que se iban a utilizar en los ensayos. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos el día antes del ensayo. Los ensayos antivirales se realizaron a una concentración reducida de FBS del 2%.

Las líneas celulares de adenocarcinoma humano H1 HeLa (ATCC, Manassas, VA, Cat# CRL-1958) se mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco/Thermo Fisher Scientific) suplementado con FBS al 10 % (v/v).

Las células Vero y las células Huh-7 se adquirieron de America Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD). Las células Vero se mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa que contenía 10% de FBS (HyClone Laboratories) y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 °C con 5% de CO2. Las células Huh-7 se mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con GlutaMAX 4 mM, piruvato de sodio 110 mg/l, NEAA al 1 %, FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Todo el medio de cultivo, los suplementos y los antibióticos se adquirieron en Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA).

La multiplicidad de infección (MOI) utilizada en los ensayos antivirales introductorios se resume en la Tabla S4.

El ensayo antiviral del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) fue un ELISA de nucleoproteína anti-OC43. Específicamente, se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos (Corning Life Sciences, Durham, NA) a 0,1 ml/pocillo a 0,144 x 106 células/ml en medio de crecimiento. Después de que las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 % (v/v) durante la noche, se añadió a cada pocillo 0,1 ml por pocillo de virus OC43 diluido con el medio de crecimiento a 1,103 x 104 ufp/ml junto con muestras seriadas. compuestos de prueba diluidos dispensados ​​por un dispensador digital HP D300e (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) con un volumen final de 0,2 ml/pocillo. El cultivo se mantuvo en una cámara humidificada a 33 °C con 5% (v/v) de CO2 durante 72 h. Después de la incubación, se retiraron los medios de cultivo y las células se fijaron con metanol al 100% durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se secaron al aire durante diez minutos después de retirar el fijador. Posteriormente, las placas se bloquearon con 0,1 ml/pocillo de FBS al 10 % (Hyclone Laboritories), leche en polvo al 5 % (AmericanBio, Canton, MA), Tween 20 al 0,1 % (EMD Millipore, Burlington, MA) en PBS (tampón de bloqueo) para 30 minutos a 37°C. Después de eliminar el tampón de bloqueo, el anticuerpo antinucleoproteína OC43 (EMD Millipore) se diluyó 2000 veces con el tampón de bloqueo y se agregaron 50 µl a cada pocillo y se incubaron durante dos horas a 37 °C. Luego, las placas se lavaron con 0,2 ml por pocillo de Tween 20 al 0,1 %/PBS cinco veces y se añadió 50 µl por pocillo de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Invitrogen, Waltham, MA) a una dilución de 1:4000. en el buffer de bloqueo. Después de 1 h de incubación a 37 °C, las placas se lavaron cinco veces con 0,2 ml por pocillo de Tween-20 al 0,1 % en PBS. Las señales de HRP se desarrollaron añadiendo 0,1 ml por pocillo de reactivo 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Thermo Fisher Scientific) e incubando a temperatura ambiente hasta que el control positivo fue evidente. En ese momento, la reacción se detuvo añadiendo 0,1 ml/pocillo de solución de parada de TMB (LGC SeraCare, Milford, MA). Las señales se midieron mediante absorbancia a 450 nm con un lector de placas EnVision (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los datos se analizaron utilizando el software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Para probar la citotoxicidad del compuesto, se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos (Corning Life Sciences) a 0,1 ml/pocillo a 0,144 x 106 células/ml en medio de crecimiento. Después de que las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 % (v/v) durante la noche, se añadió a cada pocillo 0,1 ml de medio de crecimiento por pocillo junto con compuestos de prueba diluidos en serie dispensados ​​mediante un dispensador digital HP D300e (Hewlett Packard) con un volumen final de 0,2 ml/pocillo. El cultivo se mantuvo en una cámara humidificada a 33 °C con 5% (v/v) de CO2 durante 72 h. Después de la incubación, se midió la viabilidad de las células Huh-7 utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) según el protocolo del fabricante. Las señales de luminiscencia se registraron mediante un lector de placas EnVision. La viabilidad celular relativa se calculó normalizando la absorbancia de los pocillos tratados con el compuesto con respecto a la de los pocillos tratados con DMSO (establecida en 100%). La viabilidad celular relativa (eje Y) versus los valores log10 de la concentración del compuesto (eje X) se representaron en el software Prism (versión 8). Los valores de CC50 (la concentración de compuestos de prueba necesarios para reducir la viabilidad celular en un 50%) se calcularon utilizando un modelo de regresión no lineal (cuatro parámetros).

El ensayo antiviral del coronavirus humano 229E (HCoV-229E) fue un ELISA antinucleoproteína con células H1 HeLa infectadas. Se sembraron células H1 HeLa en placas de 96 pocillos (Corning) a 0,1 ml/pocillo a 0,12 x 106 células/ml en Opti-MEM (Gibco, Waltham, MA) suplementado con FBS al 2%, y se incubaron a 37 °C en una cámara de cultivo de tejidos humidificada que contiene 5% (v/v) de CO2 durante la noche. Al día siguiente, el stock de HCoV-229E se diluyó a 1,283 × 104 ufp/ml con FBS al 2 % en Opti-MEM y se distribuyó en las placas de 96 pocillos a 0,1 ml por pocillo. Los compuestos de prueba se distribuyeron en cada pocillo utilizando un dispensador digital HP D300e con un volumen final de 200 µl/pocillo. Después de que las placas se centrifugaron a 700 g durante una hora a temperatura ambiente, se mantuvieron en una cámara humidificada a 33 °C con 5% (v/v) de CO2 durante 0 o 96 h. Después de la incubación, se eliminó el medio y las placas se fijaron con metanol al 100% durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró el fijador y las placas se secaron al aire durante 15 a 30 minutos. Posteriormente, las placas se bloquearon con 0,1 ml/pocillo de FBS al 10 % (HyClone), leche en polvo al 5 % (AmericanBio), Tween 20 al 0,1 % (EMD Millipore) en PBS (tampón de bloqueo) durante 30 min a 37 °C. Después de eliminar el tampón de bloqueo, se agregaron a cada pocillo 0,05 ml/pocillo de anticuerpo policlonal de conejo de nucleoproteína HCoV-229E diluido 5000 veces (Sino Biological, Beijing, China) en el tampón de bloqueo y se incubó durante 2 h a 37 °C. Luego, las placas se lavaron con 0,2 ml por pocillo de Tween-20 al 0,1%/PBS cinco veces y se añadió 50 µl por pocillo de anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con HRP (ImmunoReagents, Raleigh, NC) diluido 1:4000 en el tampón de bloqueo. . Después de una hora de incubación a 37 °C, las placas se lavaron cinco veces con 0,2 ml por pocillo de Tween 20 al 0,1 % en PBS. Las señales de HRP se desarrollaron agregando 0,1 ml por pocillo de reactivo TMB (Thermo Scientific) e incubando a temperatura ambiente hasta que el control positivo fue evidente. En ese momento, la reacción se detuvo añadiendo 0,1 ml/pocillo de solución de parada de TMB (LGC SeraCare, Milford, MA). Las señales se midieron con absorbancia a 450 nm con un lector de placas EnVision. Después de restar las señales de fondo a las 0 h de las de las 96 h, se calculó la absorbancia relativa normalizando la absorbancia de los grupos tratados con el compuesto a la de los grupos tratados con DMSO (establecida en 100%). Los valores de CE50 se calcularon utilizando un modelo de regresión de pendiente variable no lineal de cuatro parámetros.

Para probar la citotoxicidad del compuesto, se sembraron células H1 HeLa en placas de 96 pocillos (Corning Life Sciences) a 0,1 ml/pocillo a 0,12 x 106 células/ml en medio de crecimiento. Después de que las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 % (v/v) durante la noche, se añadió a cada pocillo 0,1 ml de medio de crecimiento por pocillo junto con compuestos de prueba diluidos en serie dispensados ​​mediante un dispensador digital HP D300e (Hewlett Packard) con un volumen final de 0,2 ml/pocillo. El cultivo se mantuvo en una cámara humidificada a 33 °C con 5% (v/v) de CO2 durante 96 h. Después de la incubación, se midió la viabilidad de las células H1 HeLa utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las señales de luminiscencia se registraron mediante un lector de placas EnVision. La viabilidad celular relativa se calculó normalizando la absorbancia de los pocillos tratados con el compuesto con respecto a la de los pocillos tratados con DMSO (establecida en 100%). La viabilidad celular relativa (eje Y) versus los valores log10 de la concentración del compuesto (eje X) se representaron en el software Prism (versión 8). Los valores de CC50 (la concentración de compuestos de prueba necesarios para reducir la viabilidad celular en un 50%) se calcularon utilizando un modelo de regresión no lineal (cuatro parámetros).

La actividad del virus de la hepatitis C se determinó mediante la inhibición de los replicones GT1b y GT2a del VHC en líneas celulares Huh-7 con un ensayo indicador de luciferasa de alto rendimiento con 384 pocillos. Líneas celulares de replicón subgenómico GT1b y 2a. Ambas líneas celulares se derivaron de Huh-7-lunet (Con1/SG-hRlucNeo) que alberga de manera estable un replicón subgenómico del genotipo 1b o 2a del VHC con luciferasa de Renilla como indicador41.

Las líneas celulares se mantuvieron en DMEM suplementado con GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 % de FBS (Hyclone Laboratories, no inactivado por calor), 0,5 mg/ml de geneticina (G418) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 unidades/ ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y NEAA 0,1 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA). En el ensayo, se sembraron 2000 células/pocillo en 90 µl de medio de cultivo celular sin G418 en placas de ensayo de 384 pocillos (Greiner Bio-One, Monroe, NC; tratado con cultivo celular). Los compuestos se diluyeron en serie (1:3) en DMSO y se agregaron 0,4 µl de compuesto diluido a cada pocillo, generando una titulación de dosis de 10 puntos que varía de 2,3 nM a 44 µM y una concentración final de DMSO de 0,44 %. Los compuestos se probaron en pocillos cuadruplicados. Se usó vehículo DMSO como control negativo (disolvente; sin inhibición), y se usó una combinación de tres inhibidores del VHC, incluido un inhibidor de proteasa, un inhibidor de NS5A y un inhibidor de nucleósidos, en concentraciones > 100 × EC50 como control positivo ( 100% inhibición). Las placas se incubaron durante 3 días a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 y 85% de humedad.

El ensayo del replicón del VHC fue un ensayo múltiple que evaluó la citotoxicidad (CC50) además de la actividad antirreplicón (CE50) en el mismo pocillo. La actividad de replicación anti-VHC se determinó mediante la señal de luminiscencia generada a partir de la luciferasa reportera Renilla del replicón del VHC. El efecto de citotoxicidad se determinó mediante la conversión de calceína AM en producto fluorescente. Las actividades normalizadas en los ensayos se calcularon utilizando la ecuación. (1):

donde y = % de citotocidad normalizada o inhibición del replicón del VHC, XC = señal de fluorescencia del compuesto bien tratado; MB = señal de fluorescencia en pocillos de control positivo (100% de inhibición), MD = señal de fluorescencia en pocillos tratados con DMSO (0% de inhibición).

Para determinar los valores correspondientes de CC50 y EC50, las respuestas a la dosis se analizaron mediante el ajuste de una curva de regresión no lineal de 4 parámetros utilizando la ecuación. (2):

donde y = % de citotoxicidad o inhibición del replicón, m = coeficiente de Hill, [I] = concentración de inhibidor, IC50 = CC50 para citotoxicidad y EC50 para inhibición del replicón del VHC, respectivamente.

Estos ensayos se realizaron siguiendo métodos publicados42. Se sembraron células Huh-7 a 1,5 x 104 células por pocillo con FBS al 2% en una placa de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se infectaron con virus indicadores NanoLuc en presencia de diluciones en serie dobles de RDV. A las 48 h después de la infección, las células se lavaron tres veces con PBS, seguido de la adición de sustrato NanoGlo diluido 1:100 en tampón de ensayo NanoGlo. Después de 3 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas se leyeron mediante un lector de placas BioTek Cytation 5. Todos los ensayos de infección por virus informador NanoLuc se realizaron en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2).

La viabilidad de las células Huh-7 se midió utilizando el kit de ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según el protocolo del fabricante. Se sembraron células Huh-7 a razón de 1,5 x 104 células por pocillo con FBS al 2% en una placa de 96 pocillos. Después de una incubación durante la noche a 37 °C en CO2 al 5%, las células se trataron con diluciones en serie dobles del compuesto. 48 h después del tratamiento, se agregaron reactivos CellTiter-Glo en cada pocillo y la señal de luminiscencia se registró mediante un lector de placas BioTek Cytation 5. La viabilidad celular relativa se calculó normalizando la absorbancia de los pocillos tratados con el compuesto con respecto a la de los pocillos tratados con DMSO (establecida en 100%). La viabilidad celular relativa (eje Y) versus los valores log10 de la concentración del compuesto (eje X) se representaron en el software Prism (versión 8). Los valores de CC50 (la concentración de compuestos de prueba necesarios para reducir la viabilidad celular en un 50%) se calcularon utilizando un modelo de regresión no lineal (cuatro parámetros).

Ensayos de reducción del rendimiento de virus para DENV-1 Djibouti D1/H/IMTSSA/98/606 (acceso a GenBank AF298808)43, DENV-2 RL (acceso a GenBank MW741553), cepa prototipo DENV-3 H87 (acceso a GenBank M93130)44, DENV- 4 Dakar_HD_34460 (Acceso a GenBank KF907503) y ZIKV MR766 (Acceso a GenBank DQ859059) utilizando células Huh-7 se realizaron de la siguiente manera: Se sembraron células Huh-7 a una densidad de 5,5 × 103 (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, DENV-4) o 1,5 × 103 (ZIKV) células por pocillo en 100 μl de medio de cultivo DMEM/FBS al 10 % en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se infectaron a una MOI de 0,01 con DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 o ZIKV diluidos en medio de ensayo DMEM/FBS al 5 % (150 µl por pocillo). Las células se incubaron durante 2 h, después de lo cual se eliminó el inóculo viral. Después de enjuagar las células con medio de ensayo, se añadieron a las células diluciones en serie dobles (la concentración osciló entre 100 y 0,078 μM) de RDV en medio de ensayo DMEM/FBS al 5%. Después de un período de incubación de 4 (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4) o 7 (ZIKV) días, se recogió el sobrenadante y se determinó la carga de ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (RT –qPCR) como se describió anteriormente45,46. La actividad antiviral de RDV contra YFV-17D Stamaril (lote G5400; Sanofi-Pasteur) se determinó en un ensayo de reducción del efecto citopático (CPE). El ensayo se realizó como para DENV-1 a DENV-4, excepto que RDV se probó en concentraciones que oscilaron entre 100 y 0,039 μM, y la lectura (el día 4 después de la infección) se realizó mediante lectura colorimétrica utilizando el método MTS/PMS ( Promega), como se describió anteriormente47. La CE50, que se define como la concentración del compuesto necesaria para inhibir la replicación del ARN viral (para DENV y ZIKV) o el CPE inducido por el virus (para YFV) en un 50 %, se determinó mediante interpolación logarítmica.

Todos los experimentos se realizaron en un laboratorio BSL-3. Se infectaron células Huh-7 con VNO de tipo salvaje a una MOI de 0,1. Las células infectadas fueron tratadas con diferentes concentraciones de RDV. A las 48 h después de la infección, se recogieron los líquidos de cultivo. El título viral se determinó mediante ensayo de placa en células Vero48. La viabilidad de las células Huh-7 se midió como se describe en la Sección “Actividad antiviral contra DENV-1 (Pacífico Occidental), DENV-2 (Nueva Guinea C), DENV-3 (VN32), DENV-4 (MY01), YFV (YFS11). , ZIKV (PRVABC59 y Dakar) y JEV que llevan reporteros de luciferasa NanoLuc”.

Se realizaron evaluaciones antivirales de RDV para enterovirus, rinovirus y virus de la influenza en células RD, H1 HeLa y MDCK, respectivamente, mediante ensayos de efecto citopático (CPE). Se mezclaron virus y células en presencia del compuesto de prueba y se incubaron durante el tiempo indicado. El virus se tituló previamente de manera que los pocillos de control exhibieran entre un 85 y un 95 % de pérdida de viabilidad celular debido a la replicación del virus. Por lo tanto, se observó un efecto antiviral o citoprotección cuando los compuestos impedían la replicación del virus. La citoprotección y la citotoxicidad del compuesto se evaluaron mediante reducción de colorante MTS (CellTiter®96 Reagent, Promega). Se determinó el porcentaje de reducción de los efectos citopáticos virales (CPE) y se utilizó para calcular la CE50 (concentración que inhibe la replicación del virus en un 50%) y la CC50 (concentración que produce un 50% de muerte celular).

Los ensayos antivirales basados ​​en células se realizaron en placas de 384 o 96 pocillos en contención BSL-4 utilizando un sistema de imágenes de alto contenido para cuantificar la producción de antígeno viral como medida de la infección viral. Se incluyeron pocillos de control "sin virus" (BC) y pocillos de control "DMSO al 0,5%" (NC) en cada placa para determinar la señal de infección por virus del 0 y del 100%, respectivamente.

Para los ensayos de filovirus, se agregaron diez diluciones en serie del compuesto por triplicado directamente a las células utilizando el dispensador digital HP D300 en incrementos de dilución en serie dobles comenzando a 10 μM 2 h antes de la infección. Alternativamente, se utilizó una serie de diluciones seriadas dobles con 8 concentraciones de RDV de 2,5 µM a 20 nM. La concentración de DMSO en cada pocillo se normalizó al 0,5 % utilizando un dispensador digital HP D300. Las placas de ensayo se transfirieron a la suite BSL-4 y se infectaron con aislados de SUDV y MARV en una MOI que resultó en que del 20 % al 90 % de las células expresaban el antígeno del virus en el punto final del ensayo (Tabla S4). La infección se terminó fijando las células en solución de formalina 48 o 72 h después de la inoculación del virus y antes de la inmunotinción.

Los anticuerpos y tintes primarios y secundarios utilizados para la tinción nuclear y citoplasmática se enumeran en la Tabla S5. El anticuerpo primario específico para un antígeno viral particular se diluyó 1000 veces en tampón de bloqueo (1 x solución salina tamponada con fosfato [PBS; VWR, Bridgeport, Nueva Jersey] con albúmina sérica bovina al 3 % [Lampire Biological Laboratories, Pipersville, PA]) y añadido a cada pocillo de la placa de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el anticuerpo primario y las células se lavaron 3 veces con 1x PBS. Luego, las células se incubaron con el anticuerpo de detección secundaria, una inmunoglobulina G anti-ratón conjugada con Dylight488 (Thermo Fisher Scientific) en una dilución de 1 a 1000 en tampón de bloqueo. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos y el citoplasma se tiñeron con Hoechst 33,342 (Thermo Fisher Scientific) y HCS CellMask Deep Red (Thermo Fisher Scientific) para la detección de núcleos y citoplasma, respectivamente. Se adquirieron al menos cinco imágenes por pocillo mediante un instrumento de obtención de imágenes de placa confocal Opera (Perkin Elmer, Waltham, MA) utilizando un objetivo de aire de 10 ×. Las señales de la tinción del antígeno, los núcleos y el citoplasma del virus se detectaron en longitudes de onda de emisión de 488, 400 o 640 nm, respectivamente.

El análisis de imágenes se realizó utilizando el software de imágenes Acapella (Perkin Elmer, Waltham, MA), proporcionado dentro del sistema de imágenes Opera (modelo 3842, alta sensibilidad de excitación cuádruple [QEHS]; Perkin Elmer). El software se utilizó para capturar parámetros de salida basados ​​en pozos que se utilizaron para calcular el porcentaje de células infectadas, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de viabilidad. El porcentaje de células infectadas se calculó utilizando la ecuación. (3) a continuación

El número de células positivas para virus (S) se refiere al número de células en un pocillo de muestra (S) con una señal específica del virus por encima del valor umbral, mientras que el número de núcleos (S) se refiere al número de células en un pocillo de muestra (S ) con señal de tinción nuclear por encima del valor umbral. Acapella calcula directamente el porcentaje de células positivas para el virus, lo que indica el porcentaje medio de células en un pocillo de muestra (S) con una señal de intensidad de fluorescencia específica del virus por encima del valor umbral.

El análisis de la curva dosis-respuesta se realizó utilizando el software Genedata Screener (versión 18.0, Lexington, MA, https://www.genedata.com/products-services/screener) aplicando el algoritmo Levenberg-Marquardt para la estrategia de ajuste de curvas. La mayoría de los ajustes de curvas se realizaron mediante regresión no lineal de 2, 3 o 4 parámetros. Para cada curva se calcularon los siguientes valores: valor absoluto de CE50, igual al 50% de inhibición de la infección; desviación estándar para EC50 dentro de 3 o más réplicas técnicas; Pendiente de la colina, utilizada para calcular los valores de EC90; %CC que da valores de CC50 que son iguales al 50% del recuento de células; e índice de selectividad (SI), que representa la relación de CC50 a EC50.

Las células HepG2-NTCP se generaron mediante transfección de ADN plasmídico que codifica el gen del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio humano (NTCP) en células HepG2. Se seleccionó el clon HY12 con G418 y se expandió en cultivo celular para la infección por VHB. Las células se infectaron con un virus VHB de genotipo D derivado de células HepAD38 (virus AD38) a 5000 equivalentes genómicos por célula en presencia de 4% de PEG 8000 y 1,5% de DMSO durante 20 h y se incubaron en el medio con 1,5% de DMSO durante 3 días. después de que se eliminaron los inóculos del virus49. Las células infectadas se sembraron en placas de 384 pocillos (20.000 células/pocillo), se trataron con compuestos durante 5 días y se siguió con la medición del HBsAg en el sobrenadante utilizando los kits de detección de Meso Scale Diagnostics (MSD) (Rockville, MD) como se describió anteriormente50. .

El ensayo de actividad anti-VHB en PHH se realizó en un formato de 1536 pocillos utilizando un método publicado50. Las células PHH se infectaron con el virus AD38 a 500 equivalentes de genoma por célula durante 3 días y luego se tripsinizaron y se sembraron en placas de 1536 pocillos (Greiner Bio-One, Monroe, NC; tratadas con cultivo celular) a 4000 células/pocillo con recubrimiento de colágeno ( Gibco/Thermo Fisher Sciences) de 1 μL a 25 μg/mL antes de la siembra celular. Los compuestos se diluyen en serie (1:3) en DMSO. Se añaden 10 nL de compuesto diluido a cada pocillo, comenzando con una concentración final de 1 μM con una concentración final de DMSO del 1,5% en un volumen total de 9 μL de medio de cultivo. Para cada concentración de fármaco, se instalaron pocillos cuádruples en la placa de 1536 pocillos. Se usaron células PHH infectadas con DMSO al 1,5% como control negativo y células PHH no infectadas como control positivo (100% de inhibición). Las placas se incubaron durante 3 días a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 y 85% de humedad.

Se transfirieron 6 ml de sobrenadantes celulares y la mitad de los sobrenadantes se utilizaron para medir HBsAg en otra placa de 1536 pocillos (Corning) incubando con 5 ml de una mezcla de anticuerpos del antígeno de superficie HBs de detección del cliente marcado con Tb y D2 y detectando resolución temporal. fluoresce en el lector de placas Envision (PerkinElmer). La toxicidad celular se detectó agregando 1 ml de solución 2' CellTiter-Glo (Promega) en cada pocillo de la placa celular.

Los valores de EC50 se determinaron como la concentración del compuesto de prueba que provocó una disminución del 50 % en la señal de HTRF. Los valores de CC50 se determinaron como la concentración del compuesto de prueba que provocó una disminución del 50 % en la viabilidad celular.

Las células Huh7-NTCP se generaron mediante transfección de ADN plasmídico que codifica el gen del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio humano (NTCP) en células Huh7. Se seleccionó un clon de una sola célula con expresión estable de NTCP cuando se cultivó en presencia de G418. La detección IF de la replicación del HDV se realizó mediante el procedimiento descrito previamente por Ni et al.51 con modificaciones. Brevemente, las células se infectaron en masa a 37 C durante 16 h con el virus HDV de genotipo 1 producido a partir de células Huh7-END52 (proporcionadas amablemente por Stephen Urban, Hospital Universitario de Heidelberg, Alemania) a una MOI = 1 en medio DMEM (Gibco) con alto contenido de glucosa. que contenía 4 % de PEG 8000, 2,5 % de DMSO, 10 % de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Luego, las células se tripsinizaron y se sembraron a una densidad de 2000 células/pocillo en placas de 1536 pocillos (Corning) que contenían soluciones de DMSO del compuesto en concentraciones variables en DMEM suplementado con FBS al 10%, DMSO al 2,5%, penicilina 100 unidades/ml y Estreptomicina 100 unidades/ml durante 4 días. Después del tratamiento, las células se fijaron con formaldehído al 5% y se tiñeron para detectar HDAg utilizando un anticuerpo anti-HDAg de ratón (proporcionado amablemente por Stephen Urban, Hospital Universitario de Heidelberg, Alemania) y un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado AlexaFluor647 (Invitrogen). Las células se tiñeron con Hoechst 33,342 (Invitrogen) para identificar los núcleos.

Se tomaron imágenes de las células utilizando la plataforma de análisis de alto contenido ThermoFisher CellInsight CX7 con un objetivo de 10 ×. Se leyó HDAg a 650 nm y se utilizó la intensidad promedio de las regiones nucleares para identificar células infectadas con HDV. La fracción de células con intensidad promedio por encima del umbral establecido en aproximadamente 5 desviaciones estándar por encima del valor medio para el control no infectado se informó para cada condición y se usó para monitorear la inhibición del HDV.

El recuento de núcleos se leyó a 405 nm y se utilizó como marcador de citotoxicidad.

Para el análisis de los datos se utilizó el software GraphPad Prism 8. Los resultados se normalizaron para controlar los pocillos que contenían DMSO únicamente. Se utilizó una regresión no lineal para ajustar un modelo de 4 parámetros (pendiente variable) a los datos.

Las células Huh-7 se cultivan en DMEM (Gibco/Thermo Fisher Sciences) suplementado con FBS al 10 % (Hyclone Laboratories) en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada a 37 °C. Cuando las células Huh-7 tienen una confluencia del 90 al 95%, se preparan suspensiones unicelulares de células Huh-7 mediante tripsinización, se lavan dos veces con Opti-MEM® sin suero (Invitrogen) y se resuspenden a 4 × 106 células en 200 μL de BTXpress. ™ buffer (VWR, Lovaina, Bélgica).

El ARN que codifica HEV Kernow-C1 p6/luc se transcribe in vitro a partir de ADN plasmídico digerido con MluI usando el sistema de producción de ARN a gran escala T7 RiboMAX (Promega) y posteriormente se tapa usando el sistema de tapado ScriptCap m7G (Cellscript, Madison, WI).

Para determinar la actividad antiviral de RDV, se mezclan cuidadosamente 5 μg de ARN Kernow-C1 p6/Luc tapado con la suspensión celular antes mencionada en una cubeta de 4 mm (VWR International). Se utiliza un ECM 830 Electro Square Porator™ (BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA) para administrar 5 pulsos a 900 V, 99 μs. Para los pocillos de control celular, se omite el ARN viral. Las células se transfieren inmediatamente a 20 ml de DMEM completo y se siembran según sea necesario para el ensayo. Brevemente, se siembran alícuotas de 100 µl de la suspensión celular en placas de 96 pocillos que ya contienen diluciones en serie de RDV (100 µl, 2 x concentrado) en DMEM completo. Después de 4 días de cultivo a 37 °C, el nivel de replicación viral se determinó mediante la señal de luciferasa en el sobrenadante del cultivo celular. Se transfieren veinte µl del medio de cultivo a una placa de cultivo blanca de 96 pocillos (PerkinElmer) y se determina la luminiscencia producida por la luciferasa gaussia (Gluc) secretada después de la adición de 50 µl de sustrato de ensayo de luciferasa Renilla (diluido 1:100; Promega). La concentración efectiva del 50 % (CE50) se define como la concentración del compuesto que provoca una reducción del 50 % en la luminiscencia (señal Luc) en comparación con la de los controles de virus que usan [Inhibidor] versus respuesta normalizada: ajuste de curva de pendiente variable (GraphPad Prism , versión 8).

Para la evaluación de la toxicidad, el medio se retira y se reemplaza con 100 μL de un metosulfato de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2-tetrazolio/fenazina ( MTS/PMS; Promega) solución (diluida 1:10). Las células metabólicamente activas convierten el sustrato amarillo en un metabolito marrón soluble en agua. La cantidad de metabolito que se produce se correlaciona directamente con la actividad metabólica de las células, ya sea en presencia del compuesto o en presencia tanto del compuesto como del virus. Después de un período de incubación de 1 h a 37 °C, se determina para cada pocillo la densidad óptica a 498 nm. A la lectura del MTS le sigue una evaluación microscópica (control de calidad). El CC50 representa la concentración a la que la actividad metabólica de las células se reduciría al 50 % de la actividad metabólica de las células no tratadas, usando [Inhibidor] versus respuesta normalizada: ajuste de curva de pendiente variable (Graphpad Prism, versión 8).

Las células HeLa, las placas de 384 pocillos y las reservas virales (MARV Ci67 y SUDV Boniface) son las mismas que se describen anteriormente. Favipiravir se obtuvo de Fujifilm. Los compuestos se agregaron mediante un dispensador digital HP D300 (Hewlett Packard) a partir de una solución madre con 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) de modo que cada combinación se probó en 4 réplicas. Se añadió favipiravir 4 h después del cultivo celular (18 a 20 h antes de la inoculación del virus) en seis concentraciones que oscilaban entre 23,4 nM y 750 µM. Se añadió RDV a las células 2 h antes de la inoculación del virus en 9 concentraciones diferentes que oscilaban entre 4 nM y 1 µM. E864-0360, un compuesto de control USAMRIID con EC50 de 0,40 y 0,65 µM contra MARV, RAVV y SUDV Boniface, respectivamente, se añadió 2 h antes de la inoculación del virus en 10 concentraciones diferentes que oscilaban entre 50 nM y 25 µM. Se incluyeron un control en blanco de inoculación sin virus, un control neutro con infección por virus pero sin tratamiento, y un control de vehículo con infección por virus y solo DMSO para establecer valores de referencia para el análisis. Las células se fijaron en formalina tamponada al 10% al menos 48 h antes de la inmunotinción. La medida HCI de la infección por virus se describió anteriormente.

El efecto combinatorio (aditivo, sinérgico o antagonista) de favipiravir y RDV se evaluó utilizando un tablero de ajedrez convencional, donde se evaluó la dosis-respuesta de un compuesto en presencia de concentraciones crecientes del otro compuesto. La dosis-respuesta de RDV en ausencia de favipiravir y viceversa se realizó en el mismo ensayo para proporcionar control para la evaluación del efecto de la combinación. Se utilizó el software analítico Genedata Screener Synergy Module (Basilea, Suiza) para cuantificar el efecto de la combinación utilizando modelos matemáticos HSA (Highest Single Agent), independencia de Bliss y Loewe53. Para minimizar el sesgo del software, también analizamos la combinación de RDV + favipiravir para determinar la actividad anti-MARV utilizando SynergyFinder (versión 3.0)30, donde se informan las puntuaciones de sinergia. Según el límite convencional, una puntuación de sinergia de -10 a 10 se considera aditiva.

Se utilizaron tres parámetros para evaluar el efecto de la combinación según los diferentes modelos: (1) El índice de combinación (IC) mide el cambio fraccionario entre las dosis de combinación y el porcentaje de actividad de los agentes individuales. Es independiente de un modelo para la acción conjunta de los dos compuestos. Un valor de CI de 1 indica efecto aditivo, un valor inferior a 1 indica efectos sinérgicos y un valor superior a 1 indica antagonismo entre los dos compuestos; (2) El exceso de volumen se refiere a la suma de las diferencias entre el modelo y los datos ajustados, multiplicada por las diferencias de concentración entre las mediciones individuales. Los valores positivos apuntan hacia efectos sinérgicos, un valor cercano a cero indica un efecto de combinación neutral y los valores negativos apuntan hacia antagonismo; (3) La puntuación de sinergia es similar al exceso de volumen, excepto que pondera los datos según los valores de actividad de los datos medidos originales, donde los valores positivos indican niveles relativos de sinergia y los valores negativos indican niveles relativos de antagonismo.

Se evaluaron los agentes terapéuticos utilizados en regiones endémicas de SUDV y MARV para determinar posibles interacciones con RDV (Tabla S3). Los medicamentos incluyen terapias antivirales contra el VIH, medicamentos antipalúdicos y medicamentos utilizados para mejorar los síntomas de las fiebres hemorrágicas virales (OMS 2010, 2016). Las células HeLa, las placas de 384 pocillos y las reservas virales (MARV Ci67 y SUDV Boniface) son las mismas que se describen anteriormente. Cada compuesto se probó en 8 concentraciones en 3 a 4 réplicas con una dilución en tres pasos. Cada concentración de cada compuesto se añadió a los pocillos de ensayo a partir de una solución madre utilizando un dispensador digital HP D300 (Hewlett Packard). Se incluyeron un control en blanco de inoculación sin virus, un control neutro con infección viral pero sin tratamiento, un control de vehículo con infección viral, solo DMSO y un control positivo E864-0360 para establecer valores de referencia para el análisis. Se realizaron dos estudios de dosis-respuesta para cada compuesto.

Dos horas después del tratamiento, las placas se transfirieron a un laboratorio BSL-4 para inoculaciones con SUDV Boniface (MOI = 7–16 pfu/mL) o MARV Ci67 (MOI = 5–9 pfu/mL) y se incubaron durante 48 h. La infección se detuvo mediante fijación con formalina. Las infecciones se midieron mediante HCI como se describe anteriormente. El análisis se realizó como se describe anteriormente en esta Sección "Interacciones de Remdesivir con medicamentos concomitantes".

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Agradecemos a Katrien Geerts, Caroline Collard y Elke Maas por su asistencia técnica. Agradecemos a Becky Norquist por editar este manuscrito.

Este trabajo fue financiado por Gilead Sciences, China Scholarship Council, 201906170033.

Fundación de Ginebra, Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados Unidos (USAMRIID), Fort Detrick, Frederick, MD, EE. UU.

Sheli R. Radoshitzky, Patrick Iversen, Kelly S. Stuthman, Sean A. Van Tongeren, Jesse Steffens, Travis Warren y Jay Wells

División de Antivirales, Oficina de Enfermedades Infecciosas, Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos, Administración de Alimentos y Medicamentos, Silver Spring, MD, EE. UU.

Sheli R. Radoshitzky

Gilead Sciences, Inc, 333 Lakeside Drive, Foster City, CA, EE. UU.

Xianghan Lu, Ruoyu Gong, Hoa Truong, Annapurna A. Sapre, Huiling Yang, Xiaodong Xie, Jia Jun Chia, Zhijuan J. Song, Stacey M. Leventhal, Josolyn Chan, Alex Shornikov, David Cowfer, Helen Yu, Tomas Cihlar, Danielle P. Porter, John P. Bilello y Joy Y. Feng

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto para el Descubrimiento de Fármacos, Centro Sealy de Biología Estructural y Biofísica Molecular, Rama Médica de la Universidad de Texas, Galveston, TX, EE. UU.

Jing Zou y Pei-Yong Shi

KU Leuven Departamento de Microbiología, Inmunología y Trasplantes, Laboratorio de Virología y Quimioterapia, Instituto Rega de Investigación Médica, B-3000, Lovaina, Bélgica

Suzanne JF Kaptein, Xin Zhang y Johan Neyts

Red mundial de virus, GVN, Baltimore, EE. UU.

Suzanne JF Kaptein, Xin Zhang y Johan Neyts

Laulima Government Solutions, LLC., Orlando, FL, EE. UU.

Travis Warren

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JYF, SRR, PI, XL, JZ, SJFK y JPB escribieron el texto principal del manuscrito. KSS, SAVT, JS, RG, HT, AAS, HY, XX, JJC, ZJS, SML, JC, AS, XZ y HY contribuyeron a la curación, el análisis y la metodología de los datos. TW, JW, TC, JPB, JN y PYS conceptualizaron y supervisaron el trabajo. DC y DPP facilitaron el mantenimiento de registros y la transferencia de material/datos entre instituciones. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Joy Y. Feng.

XL, RG, HT, AAS, HY, XX, JJC, ZJS, SML, JC, AS, DC, HY, TC, DPP, JPB y JYF poseen posibles intereses en competencia y los autores restantes no tienen ningún interés en competencia. XZ recibió financiación del Consejo de Becas de China (Subvención No.201906170033). Este artículo refleja las opiniones de los autores y no debe interpretarse como que representa las opiniones o políticas de la FDA.

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Reimpresiones y permisos

Radoshitzky, SR, Iversen, P., Lu, X. et al. Perfil ampliado de Remdesivir como antiviral de amplio espectro y bajo potencial de interacción con otros medicamentos in vitro. Representante científico 13, 3131 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29517-9

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Recibido: 16 de noviembre de 2022

Aceptado: 06 de febrero de 2023

Publicado: 23 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29517-9

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